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青贮饲料品质评定

2016-12-08字号:[ ]

  传统的可培养方式在实验室条件下,可以大致得到各种菌的分类和数量,能反映一定的微生物结果。由于微生物菌群在进行纯培养时,不可避免地会造成菌株的富集或衰减,人为地改变了原始菌群的微生物生态构成,对研究结果有时会造成较大偏差。许多研究结果表明,自然环境中有相当多的微生物(90%~99%)是用纯培养的方法无法培养出来的。同时,纯培养分离方法采用配制简单的营养基质和固定的培养温度,忽略了生物相互作用的影响。这种人工环境与原生环境的偏差,使得可培养的种类只占总数的0.1%~1%。因此,由于绝大多数微生物无法经培养得到,丢失了大量微生物资源,也使得对微生物多样性的认识较片面。在这种情况下,往往借用非培养的手段评定微生物。
  大量研究证明,原核生物rRNA中的16SrDNA全长约1540bp,片段长度适中,信息量较大且易于分析。在细菌的16SrDNA中有多个区段高度保守,根据这些保守区人们可以设计出细菌的通用引物,用来扩增出所有细菌的16SrDNA片段。而细菌的16SrD?NA也含有可变区的差异,根据这些差异可以用来区分不同的菌。
  16SrDNA序列分析技术是从微生物样本中提取16S的基因片段,通过克隆、测序或酶切、探针杂交等获得16SrRNA序列信息,再与16SrRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比对,确定其在进化树中的位置,从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。常用的方法有以下几种:
  末端限制性片段长度多态性技术(TRFLP)。提取青贮饲料中微生物的总DNA,用在5’端用荧光物质标记的引物进行PCR扩增,得到的产物用适合(一般选择酶切位点为4bp)的限制性内切酶进行消化。因为不同种类微生物16S序列不同,所以它们的酶切位点也会有差异,消化产物以DNA测序仪进行分离检测,通过激光扫描,得到荧光标记端片段的图谱。图谱中条带(或波峰)的多少表明了群落的复杂程度。峰面积的大小代表了该片段的浓度,即相应菌的相对数量(图7)。这些末端标记的片段可以反映微生物区系的组成变化。根据末端限制性片段(TRFs)的长度与现有数据库进行比对,直接鉴定群落图谱中的单个菌种(图8)。
  变性梯度凝胶电泳(DGGE)。提取微生物样品中的总DNA,以混合的微生物总DNA作模板,用同一套PCR引物进行扩增。因不同微生物扩增的16SDNA片段不同,在含有化学变性剂尿素(urea)和甲酰胺(Formamide)梯度的聚丙烯酰胺凝胶中泳动时,不同微生物在DGGE分析胶上产生不同的迁移距离,从而被分离开来。不同种属的细菌可以在胶图上就可以反映出不同的信息,从而得到菌群的大致分布(图9)(具体实验方法及步骤参见《全株玉米青贮制作与质量评价》(孟庆翔、杨军香主编)附录G)。
  SSCP(singlestrandconformationpolymorphism)。空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。在分析青贮微生物时,首先提取青贮饲料中微生物的总基因组DNA,其次PCR扩增16S,再将特异的PCR扩增产物变性,而后快速复性,使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子,最后将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过放射性自显影、银染或溴化乙啶显色分析结果(图10),进而测序,得到青贮微生物的组成。
  由上述传统方法得到的实验结果中往往只含有数十条条带,只能反映出样品中少数优势菌的信息;另外由于分辨率的误差,部分电泳条带中可能包含不止一种16SrDNA序列。因此,要获悉电泳图谱中具体的菌种信息,还需对每一条带构建克隆文库,并筛选克隆进行测序,实验操作过程相对繁琐。此外,采用这些方法,也无法对样品中的微生物做到绝对定量,判断微生物的丰度也不是非常准确。随着测序成本的下降,利用高通量测序成为研究环境微生物的最优选方案。
  高通量测序。对微生物群落进行高通量测序包括两类,一类是通过16SrDNA、ITS区域进行扩增测序,分析微生物的群体构成和多样性;另外一类是宏基因组测序,是不经过分离培养微生物,而对所有微生物DNA进行测序,利用生物信息学手段分析微生物群落的构成(图11)。
  以16SrDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析。目前的生物信息学分析也可以基于16SrDNA(V3-V4)的测序,但对微生物分类在一般情况下只能进行到属的鉴定(图12)。
  四、霉菌毒素安全评价
  青贮饲料的安全评价主要集中在青贮原料本身或青贮过程中产生的有毒有害物质。原料本身携带的主要有毒有害物质是重金属、硝酸盐、亚硝酸盐和氰化物,在收贮过程中可有效控制其含量。
  青贮过程中产生的有毒有害物质主要是霉菌毒素。由于饲料中霉菌毒素可通过动物代谢到人类可食用的畜禽产品中,并且近年来饲料中霉菌毒素污染事件常有发生。《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》(GB2761-2011)规定乳及乳制品中黄曲霉毒素每毫升限量为0.5μg/kg;《饲料卫生标准》(GB13078-2001)规定了奶牛精料补充料中黄曲霉毒素B1限量为10μg/kg,肉牛精料补充料中黄曲霉毒素B1限量为50μg/kg,玉米、花生饼(粕)、棉籽饼(粕)、菜籽饼(粕)限量为50μg/kg,豆粕限量为30μg/kg。然而,却没有对青贮玉米中霉菌毒素等危害因子限量做出规定。因此,青贮饲料中霉菌毒素的评价是反刍动物养殖者和科研机构应该重点关注的内容。
  (一)青贮饲料中霉菌毒素评定的指标
  研究发现,青贮饲料中霉菌毒素的主要种类为黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素。因此,青贮饲料中霉菌毒素评定的主要指标为黄曲霉毒素,其次为玉米赤霉烯酮和呕吐毒素(表8)。
  (二)国外青贮饲料中霉菌毒素限量值
  美国威斯康辛大学研究表明,青贮饲料中黄曲霉毒素含量应该小于20μg/L,玉米赤霉烯酮含量应该小于300μg/L,呕吐毒素含量应该小于6μg/L,见表9。
  表9青贮饲料
  中霉菌毒素的限量
  (三)测定方法
  饲料中黄曲霉毒素B1在层析过程中与胶体金标记的特异性抗体结合,抑制了抗体和硝酸纤维素膜检测线上黄曲霉毒素B1-BSA偶联物的免疫反应,使检测线颜色变浅,通过检测颜色变化进行测定。具体测定方法见《全株玉米青贮制作与质量评价》(孟庆翔、杨军香主编)附录H。
  五、消化率评定
  青贮玉米经过感官评定、理化评定、微生物评定和霉菌评定后,还必须确定其消化利用的效率。青贮消化率的高低能够反映动物对青贮玉米养分的利用效率,能够很好地评价青贮的降解特性和营养价值。因此,全株玉米青贮的消化率评定,对于青贮品质的判定以及全株玉米青贮的推广都有重要指导意义。青贮饲料消化率评定方法主要有体内法(invivo)、半体内法(insitu)和体外法(invitro)。
  (一)体内法
  体内法又称活体法,是指利用活体动物评定青贮饲料营养价值的方法。基本原理是:给动物安装真胃瘘管和十二指肠瘘管,从瘘管采取食糜样本,结合示踪元素标记技术,测定食糜养分在动物消化道的消化利用。主要用于测定饲料蛋白质的瘤胃降解率、瘤胃微生物蛋白(MCP)合成效率、碳水化合物在瘤胃中的降解率和评定能氮平衡等。
  该方法的优点是最接近动物的生理条件,比较准确,具有可靠性和真实性,是其他方法参考对照的标准方法。缺点是试验动物的花费成本高、降解率受各种不稳定性因素(饲养水平、饲喂量、饲喂次数、试验动物大小以及安装瘘管后试验动物处于非正常生理状态)的误差影响,方法复杂、费时费力。因此,体内法仅适用于全混合日粮养分、消化率的评定,而不适于单一青贮玉米饲料样本的常规测定。
  (二)半体内法
  半体内法主要是指瘤胃尼龙袋法,是一种借助瘘管动物和尼龙袋评定饲料在瘤胃内降解速度和程度的方法,目前在国内外普遍采用。有科学家首次把饲料放入天然丝袋中研究饲料在羊瘤胃中的降解率,20世纪70年代后,此法就一直被广泛推广应用,不同的研究者也对具体情况进行了标准化。该方法将一定规格的装有待测饲料的尼龙袋放入装有瘤胃瘘管的动物的瘤胃内进行培养,分别在不同的降解时间点取出后,测定发酵后的饲料残渣,计算不同时间点饲料养分的降解率。如果测定多个时间点的降解率,就可以计算出瘤胃发酵参数,即根据饲料蛋白质从尼龙袋中消失的数学模型,饲料蛋白质的瘤胃降解率与时间的关系为:p=a+b(1-e-kt)。其中,p代表尼龙袋在瘤胃中滞留时间t后的饲料蛋白降解率,a为快速降解蛋白,b为慢速降解蛋白,随着滞留时间的增加,慢速降解蛋白的降解率逐渐增加,k为慢速降解蛋白降解的速度常数。装有饲料的尼龙袋在瘤胃中滞留不同的时间,可测定饲料蛋白瘤胃降解率的时间曲线,并根据最小二乘法数据拟和求出饲料蛋白的瘤胃动态降解率。待测饲料可用重铬酸钠标记,通过Cr(标记物)流出瘤胃的速度测定待测饲料流出瘤胃的速度k。在实践中,青贮玉米的瘤胃流通速度按0.06h计算。在不同时间点(6、12、24、36、48、72h)测定其相应的消化率,再根据不同时间点的消化率来计算饲料样品的有效降解率。
  瘤胃尼龙袋法的优点是试验在动物体内进行,操作简单,成本低,比体外法更能反映瘤胃的实际生理状况,便于推广应用。缺点是受日粮精粗比、动物个体差异、样品的量和颗粒大小、尼龙袋的洗涤方法、微生物的污染及尼龙袋的规格等诸多因素对尼龙袋试验结果的影响。有研究指出,瘤胃尼龙袋法评定含有大量可溶部分的饲料时,瘤胃有效降解率测定结果有偏高的趋势。此外,瘤胃尼龙袋法测定消化率时,还应注意到,微生物对品质不同的粗饲料的附着情况会使试验结果失真,因为微生物在尼龙袋内残留物上的附着使饲料蛋白质的降解率偏低。尽管如此,相对于传统方法,尼龙袋法因其不需要复杂的分析技术,相对简单,具有良好的重复性,被广泛应用于反刍和非反刍动物饲料的营养价值评定中,是评定饲料在瘤胃内的降解率的一种常用的方法。
  (三)体外法
  1.体外产气法
  体外产气法是一种瘤胃模拟技术。原理是根据各种饲料在体外用瘤胃液消化所产生气体(CO2和CH4)的比率来估计有机物消化率。用于测定气体的方法有Menke法、液体置换法、压力计法及压力感受器系统,目前较普遍采用的体外产气技术依据器材不同分为注射器式与压力传感器式系统。压力传感器是将传感器与计算机相连,能在较短时间内分析大量样品,节省时间和劳动力。中国农业大学杨红建等在前人研究的基础上,自行研发了AGRS-Ⅲ型体外发酵产气自动记录系统,该系统采用压力传感器原理,能测定从0时刻开始的产气量,当发酵容器内累计产气量达到标定产气量时,系统会自动记录产生该气量的累计时间(h)和累积产气量(mL)。
  体外产气法与传统的体内消化法相比,操作方法简便、快捷,测定数据重复性好,而且测得的有机物消化率与在活体内测定的结果呈显著正相关,有较高的应用价值。但体外产气法毕竟是一种体外模拟技术,发酵容器不同于真正的瘤胃,瘤胃食糜不能外流,发酵终产物容易积累,致使发酵容器内环境发生改变,试验结果的准确性受到影响。
  2.人工瘤胃法
  人工瘤胃技术是体外研究瘤胃微生物营养与代谢的一类技术方法,又称瘤胃模拟培养法。其原理是,采集动物的瘤胃液对饲料进行体外培养,以达到接近瘤胃内环境来研究饲料样品的降解率。人工瘤胃技术分为短期人工瘤胃发酵法和长期人工瘤胃发酵法。
  短期人工瘤胃发酵装置可以根据研究目的进行不同的设计,其共同特点是静态发酵,不对底物和产物进行分离,因而只能持续较短的时间。但试验装置简单,在饲料营养价值评定等研究方面仍具有很大的价值。该方法的缺陷在于只能测定某一时间点的降解率,不能测定动态降解率。
  长期持续动态人工瘤胃发酵系统的结构较为复杂,可以应用于常规饲料营养价值评定、蛋白质饲料瘤胃保护技术、各种化学试剂和药物对微生物代谢影响及瘤胃营养调控等方面的研究。由于应用持续动态人工瘤胃系统进行的研究通常要求持续发酵时间为2天~10天,因此对整个系统的技术条件有严格的要求,通过控制发酵条件及内容物的排出来模拟瘤胃内的实际环境,以接近瘤胃发酵的真实情况。此方法可以在较长时间内研究饲料的动态降解率,虽然该法仍需瘘管动物,但相比尼龙袋法更具灵活性,是一种较好的实验室评定方法。
  3.酶解法
  酶解法是用酶溶液代替瘤胃液对饲料营养价值进行评定的一种体外法,能较好地估测饲料的体内干物质消化率。与体外发醉法相比,酶解法简单、准确、重复性好,不需要瘘管动物。但实际研究中,很难只用一种蛋白酶来反映青贮样品蛋白质降解特征,研究者多采用复合酶法。其中,用胃蛋白酶-纤维素酶的复合酶法评定青贮饲料有机物降解率,适合我国评定青贮饲料干物质消化率。
  酶解法的缺点是只测定某一时间的降解率而忽视其动态降解率,而且瘤胃中微生物对蛋白质的消化过程非常复杂,用酶解法去模拟瘤胃内的降解存在一定的局限性。但酶解法在近年来的研究中都在应用,测定结果与体内法或半体内法具有较高的相关性。
  (四)小肠营养物质消化吸收评定
  用小肠可消化养分来评定反刍动物饲料营养价值和营养需要符合反刍动物的消化代谢特点,主要是对过瘤胃养分消化率的评定,是反刍动物营养研究的一个重要领域。饲料营养物质在瘤胃微生物和后部消化道的消化作用下转化为可吸收的营养物质,大部分营养物质经小肠吸收后参与机体代谢。用小肠可消化养分评定反刍动物青贮饲料营养价值,是一种符合反刍动物的消化代谢特点、更加准确的评定方法。目前小肠营养物质消化吸收的评定方法主要有移动尼龙袋法和酶解三步法。
  1.移动尼龙袋法
  测定原理:一定量的饲料样品在瘤胃中经过16h发酵降解后,采集一定量的瘤胃非降解饲料残渣样品置于一定尺寸规格的特制小尼龙袋中,经胃蛋白酶液培养一段时间后,将尼龙袋从十二指肠瘘管投入小肠中,并从回肠末端瘘管或粪便中回收尼龙袋,根据尼龙袋的粗蛋白或氨基酸消失率来估测饲料的小肠消化率。其优点是不需要测定食糜流量,避免了食糜流量测定带来的误差,实验动物可以正常饲喂,避免了日粮改变对消化代谢的影响,只需安装真胃瘘管,对动物的刺激较小,是实验室一种较好的评定方法。移动尼龙袋法存在的主要缺点有:从粪便收集尼龙袋使养分经过了大肠微生物的发酵,对测定结果有影响。尼龙袋容易在肠道中堵塞,不同尼龙袋从粪中排除的时间差异较大,收集困难。由于尼龙袋对肠道的刺激较大,加快了肠道的蠕动,使尼龙袋在肠道内的平均滞留时间低于食糜。对尼龙袋的孔径大小、饲料残渣装袋量、饲料在瘤胃内的培养时间等因素对测定结果的影响还需要进一步研究,以建立统一的标准化方法。
  2.酶解三步法
  测定原理:酶解三步法是装有饲料样品的尼龙袋在瘤胃内培养16h后,其残渣再分别经胃蛋白酶和胰蛋白酶培养一段时间,用100%三氯乙酸溶液终止酶解反应。根据上清液中的可溶性蛋白质和瘤胃降解后饲料残渣的粗蛋白来估测小肠消化率。
  酶解三步法的优点是不需要实验动物,速度快,成本低,易操作。而且酶解法可以与体内法测定结果相比较,能够逐步建立与体内法测定结果相关程度高的体外评定方法。其缺点是在体外不可能完全模拟体内的消化过程,测定结果准确性受到影响。
  具体的测定步骤见《全株玉米青贮制作与质量评价》(孟庆翔、杨军香主编)附录I。 (完)
  全国畜牧总站体系建设与推广处供稿

 

 

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